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定量PCR标准化,挑战在哪里?

来源:本站   发布时间: 2018-05-20 08:36:57   浏览:729次  字号: [大] [中] [小] [收藏]
六年前,科学家针对实时定量PCR实验中的种种问题,提出了一套统一的评估标准——MIQE指南。两年前,数字PCR版本的MIQE指南也出炉。然而,认真执行MIQE指南的实验室并不多。定量PCR标准化,挑战在哪里?Jeffrey

六年前,科学家针对实时定量PCR实验中的种种问题,提出了一套统一的评估标准——MIQE指南。两年前,数字PCR版本的MIQE指南也出炉。然而,认真执行MIQE指南的实验室并不多。定量PCR标准化,挑战在哪里?Jeffrey Perkel博士近日在《BioTechniques》上讨论了这一问题。


当零基础的人们准备开展定量PCR时,大多会请教师兄师姐。不过,对于数字PCR(dPCR)这种比较新的技术,周围的人未必有经验。同时,这种技术不像传统PCR那么简单,需要用到专门的仪器、操作和变量。Perkel认为,若未经培训的研究人员利用dPCR来定量mRNA的丰度,他们也能获得一个数字,但这个数字是否能准确代表样品本身,就不好说了。


幸运的是,一组研究人员已经开发出dPCR实验的路线图,称为digital MIQE指南。这个指南能够指导研究人员开展dPCR,包括实验设计和分析。digital MIQE论文的主要作者,LGC公司的首席科学家Jim Huggett表示:“digital MIQE是关于你论文中所包含的信息,这让我能够重复你的工作。”


然而,尽管越来越多的研究人员在实验中使用dPCR,但采用digital MIQE指南的仍是少数。根据Google Scholar的统计,digital MIQE指南自2013年发表以来被引用74次,而同期发表的dPCR文章超过400篇。同样,原先的MIQE指南自2009年以来被引用3200次,而qPCR文章超过26,000篇。


这与Nature Methods早期的一项调查一致,说明十篇文章中约有九篇未能提供最低要求的实验数据,因而有可能包含误导的结果和结论。那么,研究人员为什么会忽视MIQE指南?罗格斯大学的Andrzej Pietrzykowski认为,许多人并不知道MIQE,而有些人认为采用MIQE指南会带来额外的工作,也要花费更多的钱。


对于这种现状,digital MIQE论文的资深作者、英国安格利亚鲁斯金大学的Stephen Bustin教授认为,MIQE指南的执行需要期刊编辑的参与。尽管在过去几年数据重复性的问题引起广泛讨论,但Bustin及其同事发现,MIQE采用率与期刊的影响因子成反比。


不过,Bustin教授也表示,仪器供应商已成为MIQE指南的积极推动者。尽管还没有MIQE认证的仪器或试剂盒,但许多供应商都在向他们的客户推广MIQE指南。例如,Bio-Rad已推出了一个移动app,能实时量化是否符合MIQE。


这些工具可以使研究人员更清楚了解PCR的良好实践。不过,Huggett认为MIQE可能还面临观念的问题。有些人认为这像是专政。Huggett指出,这并不是一套规则,而是建议,其目的是帮助研究人员充分利用他们所有的,以便让每个反应都有价值。





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